Na microbiologia, é imprescindível que
conheçamos a técnica de coloração de Gram, assim como o mecanismo da mesma,
para a correta interpretação da bacterioscopia. Obviamente, além dos materiais
como corantes e bico de Busen, é de extrema importância que a coloração seja de
qualidade, para a obtenção de um resultado confiável e que de fato auxilie na
identificação do microrganismo.
O método de Gram foi descoberto pelo médico
dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram, em 1884, e por isso recebeu este nome.
Hans Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando
tratadas com diferentes corantes.
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| Hans Gram - Imagem: www.vidrariadelaboratorio.com.br |
· Gram-positivas: são bactérias que possuem
uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico e que, portanto,
coram-se de azul.
· Gram-negativas: são bactérias que possuem uma fina camada de
peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por
lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Estas bactérias
coram-se de vermelho.
Vamos aprender a técnica para entendermos o
que faz com que certas bactérias se corem de azul e outras de vermelho.
Ø Prepare a lâmina fazendo um pequeno esfregaço com a colônia ou a
amostra a ser analisada. Pode ser usado salina para melhor diluição na
preparação da lâmina.
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| Imagem: www.vidrariadelaboratorio.com.br |
Ø A maioria dos laboratórios utilizam-se o calor da chama do bico de
Bunsen para a fixação da lâmina. Entretanto, segundo o Ministério da Saúde,
este é o método original, utilizando violeta-de-genciana, mas atualmente já há
um fixador químico no violeta-de-metila (outro tipo de cristal violeta), que
dispensa a utilização da chama. Então, após a fixação, coloque sobre toda a
lâmina o cristal violeta, que é um corante de cor púrpura, e aguarde de 30
segundos a 1 minuto. Neste passo, todas as bactérias estarão coradas
igualmente, pois absorverão o corante.
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| Imagem: www.vidrariadelaboratorio.com.br |
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Ø Após este período, lave a lâmina com água destilada, e
posteriormente, aplique o lugol (solução de iodo). Esta solução fixará o
corante cristal violeta nas bactérias gram-positivas, que tem a parede mais
espessas.
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| Imagem: www.vidrariadelaboratorio.com.br |
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Ø Lave a lâmina novamente com água destilada e logo após, lave com
álcool-acetona, por cerca de 15 segundos ou até o corante azul sair da lâmina.
O álcool fará a descoloração das bactérias gram-negativas, que possuem a parede
menos espessa, e é imprescindível uma atenção a este passo, para que não
descolore muito a lâmina. Coloque rapidamente a lâmina em água corrente, para
tirar o excesso de álcool.
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| Imagem: www.vidrariadelaboratorio.com.br |
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Ø Coloque por toda a lâmina a fucsina ou a safranina. Estes são
contracorantes, de tom avermelhado, que servirão para corar as bactérias
gram-negativas que foram descoradas no passo anterior. Deixe o corante por 30
segundos a 1 minuto, e lave com água destilada.
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Ø Seque a lâmina com secador, e leve ao microscópio para a análise.
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| Imagem: www.vidrariadelaboratorio.com.br |
Observação: é importante mencionar que a padronização do método de
gram é específico para cada laboratório. Portanto, os tempos e os passos
indicados aqui podem variar de um laboratório para outro. É importante que o
procedimento operacional padrão do laboratório seja seguido.
Interpretação do resultado:
Durante o processo de coloração, o tratamento
com álcool-acetona extrai os lipídeos, resultando na porosidade ou
permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias gram-negativas. Por
este motivo, o cristal violeta aplicado no início do processo sai, e a
safranina aplicada ao final permanece. As gram-negativas coram-se então de vermelho (ou rosa).
Em contrapartida, a parede celular das
bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se
desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a
permeabilidade é reduzida. Sendo assim, essas bactérias retém o cristal violeta
e não se descoram com a aplicação do álcool. As gram-positivas
coram-se então de azul (ou roxo).
Dica
para não esquecer, uma analogia simples:
Ø Quando você está sem nenhum dinheiro na
sua conta, você está no VERMELHO (negativo).
Lembre-se então das gram-negativas.
Ø Quando você tira uma nota boa, você tira
uma nota AZUL (isso é positivo!). Lembre-se das gram-positivas.
Para finalizar, um vídeo muito bem
explicativo do Prof. Fernando Mafra, do Canal de Escola de Ciências da Vida, do
YouTube.
Aproveitem esta semana para estudar
microbiologia com o Biomedicina em Ação!
Fontes:
Técnica de Coloração de Gram. Brasília: Ministério da Saúde,
Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, 1997. 63 p.:
iI. (Série TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doenças Sexualmente
Transmissíveis e AIDS, (Brasil). II. Série TELELAB.
Universidade Federal Fluminense – Instituto Biomédico – MIP Bacteriologia
– Coloração de Gram.
Imagens: Vidraria de Laboratório.
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