segunda-feira, 4 de novembro de 2013


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Pirosequenciamento - Biologia Molecular

Estive em um evento na Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, promovido pela QIAGEN, uma empresa multinacional voltada à produção de equipamentos e kits para ensaios na Biologia Molecular. Um dos assuntos foi o pirosequenciamento, uma nova técnica que vem chamando a atenção.


O pirosequenciamento é uma nova técnica da Biologia Molecular, na qual a síntese de DNA ocorre através de um complexo de reações que inclui enzimas (ATP sulfurilase e luciferase) e substratos (adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina). O grupo pirofosfato, liberado durante a adição de um nucleotídeo, resulta na produção de luz detectável. Portanto, quando um novo nucleotídeo é incorporado em uma cadeia crescente de DNA através da DNA polimerase, pirofosfato é gerado de maneira estequiométrica, resultando na produção de ATP. O ATP produzido leva à conversão enzimática da luciferase com emissão de fótons. À medida que os componentes da reação diminuem, um novo ciclo de reagentes é introduzido e então a incorporação de nucleotídeos específicos é avaliada de maneira sequencial.
A técnica baseia-se no sequenciamento e na síntese de DNA, fornecendo dados em minutos, assim como o mesmo conceito da reação de PCR Real Time, que é a obtenção de resultados rápidos. Os passos do pirossequenciamento seguem abaixo:

Passo 1:
Fazer a extração do DNA a ser sequenciado e amplificado.

Passo 2:
Um primer de sequenciamento é hibridizado para a amplificação de PCR de uma cadeia simples, sendo que o produto desta reação servirá como molde, e incubação com as enzimas DNA polimerase, ATP sulfurilase, luciferase, apirase, e também os seus substratos adenosina 5’ fosfossulfato (APS) e luciferina.

Passo 3:
O primeiro desoxirribonucleotídeo trifosfato (dNTP) é adicionado à reação. A DNA polimerase catalisa a incorporação do dNTP na fita de DNA, se este for complementar à fita molde. Cada evento de incorporação é acompanhado pela liberação de pirofosfato (PPi) numa quantidade equivalente à quantidade de nucleotídeo incorporado.

Passo 4:
ATP sulfurylase converte PPi para ATP na presença de adenosina 5’ fosfossulfato (APS). Esse ATP dirige a conversão mediada pela luciferase, de luciferina para oxiluciferina, que gera luz visível em quantidades proporcionais à quantidade de ATP. A luz produzida é detectada por um chip e vista como um pico na saída de dados de um software. Cada pico (sinal de luz) é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados.

Passo 5:
A apirase, uma enzima de degradação de nucleotídeos, continuamente degrada nucleotídeos não incorporados e ATP. Quando a degradação está completa, mais nucleotídeos são adicionados.

Passo 6:
A adição de dNTP é realizada sequencialmente. Deve-se notar que o trifosfato de desoxiadenosina alfa-tio (dATP) é utilizado como um substituto para o natural desoxiadenosina trifosfato (dATP), uma vez que é utilizada eficientemente pela DNA polimerase, mas não é reconhecido pela luciferase. Enquanto o processo continua, a cadeia complementar de DNA é construída e a sequência nucleotídica é determinada a partir dos picos de sinal do rastreio.

Algumas aplicações
·      Estudo de deleções.
·      Quantificação de frequência de mutações.
·      Metilação – sequenciamento das ilhas CpG encontradas em regiões promotoras.

O vídeo abaixo explica como ocorre a síntese a liberação de luz para a formação dos picos em tempo real.


Fontes:
Texto modificado: Ministério da Ciência e Tecnologia.
Texto traduzido: Catálogo do PyroMark Q24 da QIAGEN.
Vídeo: youtube. 
2 comentaram

2 comentários :

  1. Tenho 2 dúvidas, se puderes respondê-las :)
    - é possível sequenciar por essa técnica o rDNA 16S de procariotos?
    - o que são os "pyrotags" gerados por essa técnica?
    Obg, no aguardo :)

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